实验6食品中膳食纤维的测定
(GB/T 5009.88-2008)
6.1总的、可溶性和不溶性膳食纤维的测定
6.1.1原理
取干燥试样，经a-淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解消化，去除蛋白质和淀粉，酶解后样液用乙醇沉淀、过滤，残渣用乙醇和丙酮洗涤，干燥后物质称重即为总膳食纤维(total dietary fiber，TDF)残渣；另取试样经上述三种酶酶解后直接过滤，残渣用热水洗涤，经干燥后称重，即得不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)残渣；滤液用4倍体积的95%乙醇沉淀、过滤、干燥后称重，得可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)残渣。以上所得残渣干燥称重后，分别测定蛋白质和灰分。总膳食纤维(TDF)、不溶性膳食纤维(IDF)和可溶性膳食纤维(SDF)的残渣扣除蛋白质、灰分和空白即可计算出试样中总的、不溶性和可溶性膳食纤维的含量。
6.1.2试剂
除特殊说明外，本标准中实验室用水为二级水，电导率(25℃)≤0.10 mS/m，试剂为分析纯。
（1）95%乙醇(CH3CH2OH)：分析纯。
85%乙醇溶液(CH3CH2OH)：取895 mL 95%乙醇置1 L容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
78%乙醇溶液(CH3CH2OH)：取821 mL 95%乙醇置1 L容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
（2）热稳定α-淀粉酶溶液：于0～5℃冰箱储存，酶的活性测定及判定标准见补充内容。
（3）蛋白酶：用MES-TRIS缓冲液(a)配成浓度为50 mg/mL的蛋白酶溶液，现用现配，于0～5℃储存。
（4）淀粉葡萄糖苷酶溶液：于0～5℃储存。
（5）酸洗硅藻土：取200 g硅藻土于600 mL的2 mol/L盐酸中，浸泡过夜，过滤，用蒸馏水洗至滤液为中性，置于525℃ ± 5℃马福炉中灼烧灰分后备用。
（6）重铬酸钾洗液：100 g重铬酸钾(K2Cr2O7)，用200 mL蒸馏水溶解，加入1800 mL浓硫酸混合。
（7）MES：2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(C6H13NO4S·H2O)。
（8）TRIS：三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3)。
（9）0.05 mol/L MES-TRIS缓冲液：称取19.52 g MES和12.2 g TRIS，用1.7 L蒸馏水溶解，用6 mol/L氢氧化钠调pH值至8.2，加水稀释至2 L。
注：一定要根据温度调pH值，24℃时调pH值为8.2；20℃时调pH值为8.3；28℃时调pH值为8.1； 20℃和28℃之间的偏差，用内插法校正。
（10）3 mol/L乙酸(HAC)溶液：取172 mL乙酸，加入700 mL水，混匀后用水定容至1 L。
（11）0.4 g/L溴甲酚绿(C21H14O5Br4S)溶液：称取0.l g溴甲酚绿于研钵中，加1.4 mL 0.1 mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250 mL。
（12）石油醚：沸程30～60℃。
（13）丙酮(CH3COCH3)。
6.1.3仪器
（1）高型无导流口烧杯：400 mL或600 mL。
（2）坩埚：具粗面烧结玻璃板，孔径40～60 μm（国产型号为G2坩埚）。坩埚预处理：坩埚在马福炉中525℃灰化6 h，炉温降至130℃以下取出，于洗液中室温浸泡2 h，分别用水和蒸馏水冲洗干净，最后用15 mL丙酮冲洗后风干。加入约1.0 g硅藻土，130℃烘至恒重。取出坩埚，在干燥器中冷却约1 h，称重，记录坩埚加硅藻土质量，精确到0.1 mg。
（3）真空装置：真空泵或有调节装置的抽吸器。
（4）振荡水浴：有自动“计时-停止”功能的计时器，控温范围（60±2）℃～（98±2）℃。
（5）分析天平：灵敏度为0.1 mg。
（6）马福炉：能控温525℃ ± 5℃。
（7）烘箱：105℃，130℃ ± 3℃。
（8）干燥器：二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂每两周130℃烘干过夜一次。
（9）pH计：具有温度补偿功能，用pH值为4.0、7.0和10.0标准缓冲液校正。
6.1.4分析步骤
6.1.4.1样品制备
样品处理时若脂肪含量未知，膳食纤维测定前应先脱脂，脱脂步骤见（3）。
（1）将样品混匀后，70℃真空干燥过夜，然后置干燥器中冷却，干样粉碎后过0.3～0.5 mm筛。
（2）若样品不能受热，则采取冷冻干燥后再粉碎过筛。
（3）若样品中脂肪含量>10%，正常的粉碎困难，可用石油醚脱脂，每次每克试样用25 mL石油醚，连续3次，然后再干燥粉碎。要记录由石油醚造成的试样损失，最后在计算膳食纤维含量时进行校正。
（4）若样品糖含量高，测定前要先进行脱糖处理。按每克试样加85%乙醇10 mL处理样品2～3次，40℃下干燥过夜。
粉碎过筛后的干样存放于干燥器中待测。
6.1.4.2试样酶解
每次分析试样要同时做2个试剂空白。
（1）准确称取双份样品（m1和m2）1.000 0 g±0.0020 g，把称好的试样置于400 mL或600 mL高脚烧杯中，加入pH=8.2的MES-TRIS缓冲液40 mL，用磁力搅拌直至试样完全分散在缓冲液中（避免形成团块，试样和酶不能充分接触）。
（2）热稳定α-淀粉酶酶解：加50 μL热稳定α-淀粉酶溶液缓慢搅拌，然后用铝箔将烧杯盖住，置于95～100℃的恒温振荡水浴中持续振摇，当温度升至95℃开始计时，通常总反应时间35 min。
（3）冷却：将烧杯从水浴中移出，冷却至60℃，打开铝箔盖，用刮勺将烧杯内壁的环状物以及烧杯底部的胶状物刮下，用10 mL蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。
（4）蛋白酶酶解：在每个烧杯中各加入(50 mg/mL)蛋白酶溶液100 μL，盖上铝箔，继续水浴振摇，水温达60℃时开始计时，在60℃ ± 1℃条件下反应30 min。
（5）pH值测定：30 min后，打开铝箔盖，边搅拌边加入3 mol/L乙酸溶液5 mL。溶液60℃时，调pH值约为4.5（以0.4 g/L溴甲酚绿为外指示剂）。
注：一定要在60℃时调pH值，温度低于60℃pH值升高。每次都要检测空白的pH值，若所测值超出要求范围，同时也要检查酶解液的pH值是否合适。
（6）淀粉葡萄糖苷酶酶解：边搅拌边加入100 μL淀粉葡萄糖苷酶溶液，盖上铝箔，持续振摇，水温到60℃时开始计时，在60℃ ± 1℃条件下反应30 min。
6.1.4.3测定
6.1.4.3.1总膳食纤维的测定
（1）沉淀：在每份试样中，加入预热至60℃的95%乙醇225 mL（预热以后的体积），乙醇与样液的体积比为4∶1，取出烧杯，盖上铝箔，室温下沉淀1 h。
（2）过滤：用78%乙醇15 mL将称重过的坩埚中的硅藻土润湿并铺平，抽滤去除乙醇溶液，使坩埚中硅藻土在烧结玻璃滤板上形成平面。乙醇沉淀处理后的样品酶解液倒入坩埚中过滤，用刮勺和78%乙醇将所有残渣转至坩埚中。
（3）洗涤：分别用78%乙醇、95%乙醇和丙酮15 mL洗涤残渣各2次，抽滤去除洗涤液后，将坩埚连同残渣在105℃烘干过夜。将坩埚置干燥器中冷却1 h，称重（包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土），精确至0.1 mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣质量。
（4）蛋白质和灰分的测定：称重后的试样残渣，分别按GB/T 5009.5的规定测定氮(N)，以N × 6.25为换算系数，计算蛋白质质量；按GB/T 5009.4测定灰分，即在525℃灰化5 h，于干燥器中冷却，精确称量坩埚总质量(精确至0.1 mg)，减去坩埚和硅藻土质量，计算灰分质量。
6.1.4.3.2不溶性膳食纤维测定
（1）按6.1.4.2（1）称取试样，按6.1.4.2进行酶解，将酶解液转移至坩埚中过滤。过滤前用3 mL水润湿硅藻土并铺平，抽去水分使坩埚中的硅藻土在烧结玻璃滤板上形成平面。
（2）过滤洗涤：试样酶解液全部转移至坩埚中过滤，残渣用70℃热蒸馏水10 mL洗涤2次，合并滤液，转移至另一600 mL高脚烧杯中，备测可溶性膳食纤维（见6.1.4.3.3）。残渣分别用78%乙醇、95%乙醇和丙酮15 mL各洗涤2次，抽滤去除洗涤液，并按6.1.4.3.3（1）洗涤干燥称重，记录残渣质量。
（3）按6.1.4.3.1（4）测定蛋白质和灰分。
6.1.4.3.3可溶性膳食纤维测定
（1）计算滤液体积：将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600 mL高型烧杯中，通过称”烧杯+滤液”总质量、扣除烧杯质量的方法估算滤液的体积。