实验5食品中还原糖的测定
(GB/T 5009.7-2008)
5.1直接滴定法
5.1.1原理
试样经除去蛋白质后，在加热条件下，以亚甲蓝作指示剂，滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液（用还原糖标准溶液标定），根据样品液消耗体积计算还原糖含量。
5.1.2试剂
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯。
（1）盐酸(HCl)。
（2）硫酸铜(CuSO4·5H2O)。
（3）亚甲蓝(C16H18CIN3S·3H2O)：指示剂。
（4）酒石酸钾钠［C4H4O6KNa·4H2O］。
（5）氢氧化钠(NaOH)。
（6）乙酸锌［Zn(CH3COO)2·2H2O］。
（7）冰乙酸(C2H4O2)。
（8）亚铁氰化钾［K4Fe(CN)6·3H2O］。
（9）葡萄糖(C6H12O6)。
（10）果糖(C6H12O6)。
（11）乳糖(C6H12O6)。
（12）蔗糖(C12H22O11)。
（13）碱性酒石酸铜甲液：称取15 g硫酸铜(CuSO4·5H2O)及0.05 g亚甲蓝，溶于水申并稀释至1000 mL。
（14）碱性酒石酸铜乙液：称取50 g酒石酸钾钠、75 g氢氧化钠，溶于水中，再加入4 g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000 mL，储存于橡胶塞玻璃瓶内。
（15）乙酸锌溶液(219 g/L)：称取21.9 g乙酸锌，加3 mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100 mL。
（16）亚铁氰化钾溶液(106 g/L)：称取10.6 g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100 mL。
（17）氢氧化钠溶液(40 g/L)：称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100 mL。
（18）盐酸溶液(1+1)：量取50 mL盐酸，加水稀释至100 mL。
（19）葡萄糖标准溶液：称取1 g（精确至0.000 1 g）经过98～100℃干燥2 h的葡萄糖，加水溶解后加入5 mL盐酸，并以水稀释至1000 mL。此溶液每毫升相当于1.0 mg葡萄糖。
（20）果糖标准溶液：称取1 g（精确至0.000 1 g）经过98～100℃干燥2 h的果糖，加水溶解后加入5 mL盐酸，并以水稀释至1000 mL。此溶液每毫升相当于1.0 mg果糖。
（21）乳糖标准溶液：称取1 g（精确至0.000 1 g）经过96℃ ± 2℃干燥2 h的乳糖，加水溶解后加入5 mL盐酸，并以水稀释至1000 mL。此溶液每毫升相当于1.0 mg乳糖（含水）。
（22）转化糖标准溶液：准确称取1.0526 g蔗糖，用100 mL水溶解，置具塞三角瓶中，加5 mL盐酸(1+1)，在68～70℃水浴中加热15 min，放置至室温，转移至1000 mL容量瓶中并定容至1000 mL，每毫升标准溶液相当于1.0 mg转化糖。
5.1.3仪器
（1）酸式滴定管：25 mL。
（2）可调电炉：带石棉板。
5.1.4分析步骤
5.1.4.1试样处理
（1）一般食品：称取粉碎后的固体试样2.5～5 g或混匀后的液体试样5～25 g，精确至0.001 g，置250 mL容量瓶中，加50 mL水，慢慢加入5 mL乙酸锌溶液及5 mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30 min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。
（2）酒精性饮料：称取约100 g混匀后的试样，精确至0.01 g，置于蒸发皿中，用氢氧化钠(40 g/L)溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250 mL容量瓶中，以下按5.2.4（1）自“慢慢加入5 mL乙酸锌溶液”起依法操作。
（3）含大量淀粉的食品：称取10～20 g粉碎后或混匀后的试样，精确至0.001 g，置250 mL容量瓶中，加200 mL水，在45℃水浴中加热th，并时时振摇。冷后加水至刻度，混匀，静置、沉淀。吸取200 mL上清液置另一 250 mL容量瓶中，以下按5.2.4.1（1）自“慢慢加入5 mL乙酸锌溶液”起依法操作。
（4）碳酸类饮料：称取约100 g混匀后的试样，精确至0.01 g，试样置蒸发皿中，在水浴上微热搅拌除去二氧化碳后，移入250 mL容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后，备用。
5.1.4.2标定碱性酒石酸铜溶液
吸取5.0 mL碱性酒石酸铜甲液及5.0 mL碱性酒石酸铜乙液，置于150 mL锥形瓶中，加水10 mL，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加约9 mL葡萄糖或其他还原糖标准溶液，控制在2 min内加热至沸，趁热以1滴/2 s的速度继续滴加葡萄糖或其他还原糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖或其他还原糖标准溶液的总体积，同时平行操作3份，取其平均值，计算每10 mL(甲、乙液各5 mL)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量或其他还原糖的质量(mg)［也可以按上述方法标定4～20 mL碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）来适应试样中还原糖的浓度变化］。
5.1.4.3试样溶液预测
吸取5.0 mL碱性酒石酸铜甲液及5.0 mL碱性酒石酸铜乙液，置于150 mL锥形瓶中，加水10 mL，加入玻璃珠两粒，控制在2 min内加热至沸，保持沸腾以先快后慢的速度，从滴定管中滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以l滴/2 s的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释后再进行正式测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约10 mL左右，结果按式(5-1)计算。当浓度过低时则采取直接加入10 mL样品液，免去加水10 mL，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于10 mL样液中所含还原糖的量，结果按式(5-2)计算。
5.1.4.4试样溶液测定
吸取5.0 mL碱性酒石酸铜甲液及5.0 mL碱性酒石酸铜乙液，置于150 mL锥形瓶中，加水10 mL，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加比预测体积少1 mL的试样溶液至锥形瓶中，使在2 min内加热至沸，保持沸腾继续以1滴/2 s的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作3份，得出平均消耗体积。
5.1.5结果计算
试样中还原糖的含量（以某种还原糖计）按式(5-1)进行计算：
X=m1m×V/250×1 000×100（5-1）
式中：X——试样中还原糖的含量（以某种还原糖计），g/100 g；
m1——碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）相当于某种还原糖的质量，mg；
m——试样质量，g；
V——测定时平均消耗试样溶液体积，mL。
当浓度过低时试样中还原糖的含量（以某种还原糖计）按式(5-2)进行计算：
X=m2m×10/250×1 000×100（5-2）
式中：X——试样中还原糖的含量（以某种还原糖计），g/100 g；
m2——标定时体积与加入样品后消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于某种还原糖的质量，mg；
m——试样质量，g。
还原糖含量≥10 g/100 g时计算结果保留三位有效数字；还原糖含量<10 g/100 g时，计算结果保留两位有效数字。
5.2高锰酸钾滴定法
5.2.1原理
试样经除去蛋白质后，其中还原糖把铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量，计算氧化亚铜含量，再查表得还原糖量。
5.2.2试剂
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯。
（1）硫酸铜(CuSO4·5H2O)。
（2）氢氧化钠(NaOH)。
（3）酒石酸钾钠(C4H4O6KNa·4H2O)。
（4）硫酸铁［Fe2(SO4)3］。
（5）盐酸(HCl)。
（6）碱性酒石酸铜甲液：称取34.639 g硫酸铜(CuSO4·5H2O)，加适量水溶解，加0.5 mL硫酸，再加水稀释至500 mL，用精制石棉过滤。
（7）碱性酒石酸铜乙液：称取173 g酒石酸钾钠与50 g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500 mL，用精制石棉过滤，储存于橡胶塞玻璃瓶内。
（8）氢氧化钠溶液(40 g/L)：称取4 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100 mL。
（9）硫酸铁溶液(50 g/L)：称取50 g硫酸铁，加入200 mL水溶解后，慢慢加入100 mL硫酸，冷后加水稀释至1000 mL。
（10）盐酸(3 mol/L)：量取30 mL盐酸，加水稀释至120 mL。
（11）高锰酸钾标准溶液［c(l/5KMnO4)=0.100 0 mol/L］。
（12）精制石棉：取石棉先用盐酸(3 mol/L)浸泡2～3 d，用水洗净，再加氢氧化钠液体(400 g/L)浸泡2～3 d，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净。再以盐酸(3 mol/L)浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成细微的浆状软纤维，用水浸泡并储存于玻璃瓶中，即可作填充古氏坩埚用。
5.2.3仪器
（1）25 mL古氏坩埚或G4垂融坩埚。
（2）真空泵。
5.2.4分析步骤
5.2.4.1试样处理
（1）一般食品：称取粉碎后的固体试样约2.5～5 g或混匀后的液体试样25～50 g，精确至0.001 g.置250 mL容量瓶中，加水50 mL，摇匀后加10 mL碱性酒石酸铜甲液及4 mL氢氧化钠溶液(40 g/L)，加水至刻度，混匀。静置30 min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。
（2）酒精性饮料：称取约100 g混匀后的试样，精确至0.01 g，置于蒸发皿中，用氢氧化钠溶液(40 g/L)中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250 mL容量瓶中。加50 mL水，混匀。
以下按5.2.4.1（1）自“加10 mL碱性酒石酸铜甲液”起依法操作。
（3）含大量淀粉的食品：称取10～20 g粉碎或混匀后的试样，精确至0.001 g，置250 mL容量瓶中，加200 mL水，在45℃水浴中加热th，并时时振摇。冷后加水至刻度，混匀，静置。吸取200 mL上清液置另一250 mL容量瓶中，以下按5.2.4.1（1）自“加10 mL碱性酒石酸铜甲液”起依法操作。
（4）碳酸类饮料：称取约100 g混匀后的试样，精确至0.01 g，试样置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250 mL容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后，备用。
5.2.4.2测定
吸取50.00 mL处理后的试样溶液，于400 mL烧杯内，加入25 mL碱性酒石酸铜甲液及25 mL乙液，于烧杯上盖一表面皿，加热，控制在4 min内沸腾，再准确煮沸2 min，趁热用铺好石棉的古氏坩埚或G4垂融坩埚抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不呈碱性为止。将古氏坩埚或垂融坩埚放回原400 mL烧杯中，加25 mL硫酸铁溶液及25 mL水，用玻棒搅拌使氧化亚铜完全溶解，以高锰酸钾标准溶液［c(1/5KMnO4)=0.1000 mol/L］滴定至微红色为终点。
同时吸取50 mL水，加入与测定试样时相同量的碱性酒石酸铜甲液、乙液、硫酸铁溶液及水，按同一方法做空白试验。
5.2.4.3结果计算
试样中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，按式(5-3)进行计算。
X=（V-V0）×c×71.54（5-3）
式中：X——试样中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，mg；
V——测定用试样液消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；
V0——试剂空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；
c——高锰酸钾标准溶液的实际浓度，mol/L；
71.54 ——1 mL 1.000 mol/L高锰酸钾溶液相当于氧化亚铜的质量，mg。
根据式中计算所得氧化亚铜质量，查附录，再计算试样中还原糖含量，按式(5-4)进行计算。
X=m3m4×V/250×1 000×100（5-4）
式中：X——试样中还原糖的含量，g／100 g；
m3——查表得还原糖质量，mg；
m4——试样质量（体积），g或mL；
V——测定用试样溶液的体积，mL；
250——试样处理后的总体积，mL。
还原糖含量≥10 g／l00 g时计算结果保留三位有效数字；还原糖含量<10 g/100 g时，计算结果保留两位有效数字。
5.2.5精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
5.2.6说明及注意事项
当称样量为5.0 g时，直接滴定法的检出限为0.25 g/l00 g，高锰酸钾滴定法的检出限为0.5 g/100 g。