本章学习重点：
了解蛋白质与氨基酸测定的意义；
熟悉食品中蛋白质的组成及含量；
掌握蛋白质测定方法的原理及应用；
掌握氨基酸测定方法的原理及应用。
11.1概述
11.1.1蛋白质的组成及含量
蛋白质是由20多种氨基酸通过肽链连接起来的具有生命活动的生物大分子，相对分子质量可达到数万至百万，并具有复杂的立体结构。元素分析结果表明，所有蛋白质分子都含有碳（50%～55％）、氢（6%～8％）、氧（19%～24％）、氮（13%～19％）、硫（0%～4％）。除此之外，有些蛋白质还含有少量磷、硒或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼等，个别蛋白质还含有碘。蛋白质在食品中含量的变化范围很宽。动物来源和豆类食品是优良的蛋白质资源。
不同蛋白质中氨基酸的构成比例及方式不同，所以不同的蛋白质含氮量不同。一般蛋白质含氮量为16%，即1份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数不同，如：玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25；花生为5.64；大米为5.95；大豆及其制品为5.71；小麦粉为5.70；高梁为6.24；大麦、小米、燕麦等为5.83；牛乳及其制品为6.38；肉与肉制品为6.25；芝麻、葵花子为5.30。
11.1.2蛋白质与氨基酸测定的意义
人和动物不能通过体内的平衡制备蛋白质，只能通过食物及其分解物中获得。测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。
此外，在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等多种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸。它们对人体有着极其重要的生理功能，如果缺乏或减少其中某一种，人体的正常生命代谢就会受到障碍。随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，越来越得到人们的重视。为提高蛋白质的生理功效而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也具有极其重要的意义。
11.2蛋白质的测定方法
测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。但因食品种类繁多，食品中蛋白质含量各异，特别是其他成分，如碳水化合物、脂肪和维生素等干扰成分很多，因此蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法。此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等，由于方法简便快速，故也多用于生产单位质量控制分析的蛋白质含量测定。经不断的研究改进，凯氏定氮法在应用范围、分析结果的准确度、仪器装置及分析操作速度等方面均取得了新的进步。另外，采用红外分析仪，利用波长在0.75～3.0 μm范围内的近红外线具有被食品中蛋白质组分吸收及反射的特性，依据红外线的反射强度与食品中蛋白质含量之间存在的函数关系建立了近红外光谱快速定量方法。
11.2.1凯氏定氮法
凯氏定氮法由丹麦化学家约翰·凯耶达尔（Johan Gutsav Christoffer Thorsager Kjeldahl）于1883年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、半微量法、自动定氮仪法等多种。它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。该法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。
样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨游离，用硼酸吸收后再用盐酸或硫酸标准溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
(1)消化：消化反应方程式如下：
2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2↑+12SO2↑+10H2O
在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入硫酸钾和硫酸铜。
①硫酸钾：加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在340℃左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高至400℃以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：
K2SO4+H2SO42KHSO4
2KHSO4△K2SO4+H2O+SO3↑
但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。
(NH4)2SO4△NH3↑+(NH4)HSO4
NH4HSO4△NH3↑SO3↑+H2O
除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。
②硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化，硫酸铜的作用机理如下：
2CuSO4△Cu2SO4+SO3↑+O2↑
C+2CuSo4△Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2H2SO4△2CuSO4+H2O+SO2↑
上述反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再生成硫酸亚铜，溶液呈现清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
(2)蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏即可释放出氨气，反应方程式如下：
2NaOH+(NH4)2SO4△2NH3↑+Na2SO4+2H2O
(3)吸收、滴定：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用。吸收与滴定反应方程式如下：
2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O
(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3
凯氏定氮法按照样品量的大小分为常量、半微量和微量。
样品中蛋白质含量计算，常量和微量法采用公式（11-1），半微量法采用公式（11-2）。
X＝c×(V1－V2)×M1000m×F×100（11-1）
X＝c×V1－V2×M1000m×10100×F×100（11-2）
式中：X——样品中蛋白质的含量，g/100 g或g/100 mL；
c——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
V1——滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积，mL；
V2——滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积，mL；
m——样品的质量或体积，g或mL；
M——氮的摩尔质量，14.01 g/mol；
F——氮换算为蛋白质的系数。
说明及注意事项如下。
(1)所用试剂溶液均用无氨蒸馏水配制。
(2)消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深的绿色。
(3)样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。
(4)若取样量较大，如干试样超过5 g，可按每克试样5 mL的比例增加硫酸用量。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3 mL后再继续加热消化。
(5)一般消化至透明后，继续消化30 min即可，但对于含有特别难以消化的含氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。
(6)蒸馏装置不能漏气。蒸馏时蒸汽要充足均匀，加碱要够量，动作要快，防止氨损失。
(7)硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。
(8)蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1 min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。
(9)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
11.2.2蛋白质的快速测定法
凯氏定氮法是各种测定蛋白质含量方法的基础，经过长期的应用和不断改进，具有应用范围广、灵敏度较高、回收率较好以及可以不用昂贵仪器等优点。但操作费时，对于高脂肪、高蛋白质的样品消化需要5 h以上，且在操作中会产生大量有害气体而污染工作环境，影响操作人员健康。
为了满足生产单位对工艺过程的快速控制分析，尽量减少环境污染和操作简便省时，因此又陆续创立了不少快速测定蛋白质的方法，如双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法、折光法、旋光法及近红外光谱法等，现对前四种方法分别介绍如下。
11.2.2.1双缩脲法
当脲被小心地加热至150～160℃时，可由2个分子间脱去1个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应式如下：
H2NCONH2+H-N(H)-CO-NH2△H2NCONHCONH2+NH3↑
双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应：